Biologia 5: luku 8 Geenitekniikka
Geenien tutkiminen aloitetaan DNA:n eristämisellä
Geenitekniikalla
tarkoitetaan biologian menetelmiä, joilla eliöiden perintöainesta eristetään,
analysoidaan, muokataan ja siirretään muihin eliöihin. Jotta geenejä voitaisiin
tutkia, muokata ja siirtää, on DNA ensin eristettävä soluista, puhdistettava ja
paloiteltava. DNA:n eristämiseen kuuluu kaksi vaihetta: DNA:n vapauttaminen
soluista solurakenteita rikkomalla sekä DNA:n saostaminen syntyneestä
liuoksesta. Bakteerien ja arkkien DNA saadaan irti soluista rikkomalla solut
emäksisillä kemikaaleilla ja kuumennuksella.
Entsyymit ovat geenitekniikan työkaluja
Koska
kaikkien eliöiden ja virusten DNA on perusrakenteeltaan samanlaista, voidaan
geenejä siirtää eliöstä toiseen. Voidaan siis yhdistää kasvin ja eläimen tai
bakteerin ja ihmisen DNA:ta ja saada siirretyt osat toimimaan uudessa
isännässä. Ilman entsyymejä perimäaineksen tutkimus ja muokkaus olisivat
mahdottomia. DNA:n käsittelyssä tarvitaankin monenlaisia entsyymejä, joista
tärkeimpiä ovat katkaisu- ja liittäjäentsyymit, proteiineja pilkkovat
proteaasit sekä DNA- ja RNA-ketjua rakentavat polymeraasientsyymit.
DNA:n
kaksoiskierremolekyylin pätkimiseen käytetään bakteereista eristettyjä
katkaisu- eli restriktioentsyymejä. Kukin entsyymi katkaisee DNA-rihman aina
tietyn nukleotidijärjestyksen kohdalta. Siksi tarvitaankin satoja erilaisia
katkaisuentsyymejä.
Kun
DNA:ta pilkotaan paloiksi käyttämällä jokaisessa kohdassa samaa
katkaisuentsyymiä, kaikki katkaisukohdat ovat samanlaisia. Ne sopivat
täsmälleen toisiinsa ja muodostavat tarttuessaan uudelleen yhteen
kaksijuosteista DNA-rihmaa emäspariperiaatteen mukaisesti. Sen lisäksi liitos
sinetöidään liittäjäentsyymin avulla, joka muodostaa uudelleen DNA-juosteita
koossa pitävät sidokset. Näin on mahdollista liittää kahdesta eri solusta tai
eliöstä peräisin olevaa DNA:ta toisiinsa.
Tumallisen
ja esitumallisen eliön DNA:ta ei voi suoraan liittää toisiinsa, koska
tumallisten eliöiden geeneissä on proteiinia koodaavien osien, eksonien,
lisäksi koodaamattomia osia eli introneja, joita esitumallisten geeneissä ei
ole. Retro-RNA-viruksista eristetyn käänteiskopioijaentsyymin avulla se
kuitenkin onnistuu. Entsyymillä voidaan tuottaa tumallisen eliön valmiin
lähetti-RNA:n emäsjärjestyksen mukaan koeputkessa ensin yksi DNA-juoste ja
siitä edelleen kaksijuosteinen DNA-molekyyli. Tätä sanotaan vastin-DNA:ksi. Se
ei sisällä introneja eikä säätelyaluetta.
Geenejä voidaan tallentaa ja kloonata geenikirjastossa
DNA:ta
voidaan varastoida bakteereihin, hiivoihin ja viruksiin. Bakteeriviljelmään
siirrettyä jonkin eliön perimää tai sen osaa sanotaan geenikirjastoksi. Bakteerit
lisääntyvät jakautumalla nopeasti, ja samalla kloonautuu myös niihin siirretty
vieras DNA. Geenien siirto bakteereihin ja niiden monistuminen jakautuvissa
bakteereissa on geenien kloonaamista. Bakteerien plasmidit ovat erinomaisia
geenin vektoreita eli kuljettimia, koska niitä on helppo eristää bakteereista
ja siirtää niihin takaisin. Myös bakteriofageja voidaan muunneltuina käyttää
vektoreina geenien siirrossa. Niiden luonnollinen ominaisuus on siirtää
perimänsä bakteeriin sen soluseinän ja –kalvon läpi ja valjastaa bakteeri
tuottamaan virus-DNA:ta. Laboratoriossa siirretään ensin katkaisu- ja
liittäjäentsyymien avulla haluttu pala
DNA:ta bakteeriviruksen DNA:han. Sitten viruksen annetaan siirtää se edelleen
bakteeriin. Näin bakteeri alkaa tuottaa uusia viruksia, joissa kaikissa on
mukana siirretty DNA-pala.
Onnistunut siirto tunnistetaan antibioottivalinnalla
Kun bakteereja
kasvatetaan alustalla, on tärkeää tunnistaa ja poimia viljelmän joukosta ne,
joissa on siirtogeenejä sisältäviä bakteereja. Esim antibioottiresistenssin
aikaansaava geeni, joka usein on plasmidissa valmiina, on siirtogeenejä
sisältävien bakteeriviljelmien löytämistä helpottava osa. Kun bakteereja
kasvatetaan alustalla, johon on lisätty antibioottia, säilyvät elossa vain ne
bakteerit, jotka kestävät kyseistä antibioottia ja joihin geenin siirto on siis
onnistunut. Antibiootin avulla tapahtuvaa tietyn bakteerikannan seulomista
suuresta bakteerimäärästä sanotaan antibioottivalinnaksi.
Geenikirjastoja on kahdenlaisia
Geenikirjasto
eli bakteeriviljelmä on järjestämätön kokoelma kloonattuja DNA-jaksoja. Jos
kyseessä on genominen geenikirjasto, siinä on mukana lajin koko DNA eli myös
geenien ulkopuolinen ja intronien sisältämä DNA sekä geenien säätelyalueet. Jos
halutaan kokoelma vain RNA:ksi luetuista geeneistä, on ensin eristettävä
tutkittavista soluista lähetti-RNA:ta ja muokattava siitä koeputkessa
käänteiskopioijaentsyymin avulla vastin-DNA. Kun se liitetään bakteeriviljelmän
plasmideihin, saadaan vastin-DNA-kirjasto, jossa ei ole geenien introneja eikä
säätelyalueita.
DNA:n tallentaminen geenikirjastoksi
- DNA:ta (esim ihmisen) eristetään ja pilkotaan jollakin katkaisuentsyymillä sopivan mittaisiksi pätkiksi.
- Samalla entsyymillä katkaistaan myös bakteerien plasmidien DNA:ta, jos ihmisen DNA halutaan tallettaa bakteeriviljelmään.
- Pilkottujen DNA-pätkien annetaan sitten liittyä plasmideihin tai faageihin, joiden avulla ne siirtyvät bakteerien sisään.
DNA:ta monistetaan entsyymien avulla polymeraasiketjureaktiossa
PCR-menetelmä
eli polymeraasiketjureaktio on bakteereissa tehtävää DNA:n monistamista
nopeampi ja tehokkaampi tapa. PCR:n toiminta perustuu kuumien lähteiden
bakteereista eristetyn DNA-polymeraasientsyymin käyttöön koeputkessa sekä
monistettavien DNA-palojen toimimiseen malleina. Menetelmässä tarvitaan myös
neljänlaisia nukleotideja sekä alukkeita, jotka ovat välttämättömiä DNA-polymeraasin
toiminnalle.
PCR:n
avulla DNA:ta voidaan monistaa erittäin nopeasti ilman aikaa vievää kloonausta
bakteeriviljelmässä. Oikeuslääketieteessä ja isyystutkimuksissa menetelmää
käytetään yksilöntunnistuksen apuna.
Polymeraasiketjureaktio
PCR-menetelmällä
saadaan DNA:ta monistettua. Menetelmä perustuu eri vaiheiden vuorotteluun,
jolloin lämpötilaa muuttamalla saadaan DNA-ketju vuoroin avautumaan ja vuoroin
rakentumaan uudelleen. Jokaisessa vaiheessa mallina olevan DNA:n määrä
kaksinkertaistuu. Vaiheet toistetaan kymmeniä kertoja. Ensimmäisessä vaiheessa
lämpötilaa kohotetaan niin, että DNA-juosteet eroavat. Toisessa vaiheessa
lämpötilaa lasketaan, jolloin alukkeet pariutuvat juosteiden kanssa.
Kolmannessa
vaiheessa nostetaan taas lämpötilaa, jolloin lämpöä sietävä DNA-polymeraasi
rakentaa uudet juosteet. Kyseistä DNA-polymeraasientsyymiä on eristetty kuumien
lähteiden bakteereista. Neljännessä vaiheessa samat vaiheet toistetaan, minkä
tuloksena on neljä molekyyliä. Viidennessä vaiheessa toistetaan taas samat
vaiheet, ja toisto toistolta DNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti.
DNA-palojen erottelu tehdään elektroforeesin avulla
Elektroforeesin
avulla voidaan erotella erikokoisia DNA-, RNA- ja proteiinimolekyylejä.
Erottelussa käytetään apuna hyytelömäistä geeliä, jonka reunaan pipetoidaan
paloitellut näytteet tiettyihin koloihin. Sitten systeemiin kytketään
sähköjännite. Menetelmä perustuu siihen, että DNA-molekyylit ovat
fosfaattiryhmiensä vuoksi negatiivisesti varautuneita ja liikkuvat sen takia
sähkökentässä positiivista varausta kohti.
DNA-palat
liikkuvat kohti positiivista varausta sitä nopeammin, mitä pienempiä ne ovat.
Pitkät palat ehtivät liikkua vain lyhyen matkan, koska tiheä väliaine hidastaa
niiden liikettä enemmän. Elektroforeesiajon loputtua haluttu raita voidaan
leikata irti geelistä ja puhdistaa siitä DNA. Eri DNA-näytteistä saatuja
raitoja voidaan vertailla keskenään ja käyttää saatuja tuloksia esim
yksilöntunnistuksessa.
Elektroforeesi. Kuva Googlen kuvahaku.
Yksittäinen geeni etsitään koettimen tai PCR:n avulla
Koetin
tarkoittaa geenitunnistinta. Se on geenin etsinnässä käytettävä työkalu ja en
avulla geeni voidaan tunnistaa esim bakteeriviljelmässä olevasta
geenikirjastosta. Geeni voidaan tunnistaa ja eristää myös PCR: ja
elektroforeesin avulla. Koetin on lyhyehkö, yksijuosteinen DNA:n tai RNA:n
jakso, joka varta vasten kootaan laboratoriossa. Sen käyttö perustuu
nukleiinihappojen hybridisaatioon eli juosteiden pariutumiseen emäsperiaatteen
mukaisesti. Siksi koetin pariutuu yksijuosteiseksi tehdyn DNA:n kanssa, jos
juosteiden emäsjärjestykset vastaavat toisiaan.
Koettimeen
liitetään merkkiaine, joka erottuu UV-valossa tai värireaktiossa. Sen avulla
koetin ja myös etsitty geeni löytyvät elektroforeesin geelissä olevista
raidoista tai geenikirjastosta kasvatetuista bakteeri-, faagi- tai
hiivaviljelmistä.
Koettimen
avulla voidaan tehdä geenitesti eli selvittää, onko jollain henkilöllä esim
perinnöllistä sairautta aiheuttava alleeli, ns. ”sairausgeeni”. Bakteereissa
oleviin geenikirjastoihin perustuva menetelmä on hankala ja melko hidas, mutta
se sopii pitkien DNA-jaksojen etsimiseen. PCR-menetelmä onkin useimmiten nopein
ja yksinkertaisin keino löytää ja eristää geeni.
Geenin poiminta geenikirjastosta koettimen avulla
Koetin
liittyy tutkittavassa DNA:ssa kohtaan, joka vastaa sen emäsjärjestystä. Ensin
bakteeeriviljelmän päälle painetaan huokoinen kalvo, johon bakteereja siirtyy.
Kalvoa käsitellään siten, että bakteerit hajoavat ja niiden DNA:n kaksoiskierre
aukeaa. Sitten kalvoa käsitellään liuoksella, jossa on merkkiaineella leimattu
koetinta.
Koetin
tarttuu niihin täpliin, joissa etsitty geeni on. Sen jälkeen kalvo värjätään, jolloin
leimatun koettimen ansiosta syntyvät väripisteet osoittavat etsityn geenin
sijainnin kalvolla. Kalvo on peilikuva maljasta. Sen perusteella löydetään myös
maljalla olevan etsityn bakteeripesäkkeen sijainti. Pesäke sisältää tietyn
geenin ja otetaan jatkokasvatukseen.
DNA-sirujen avulla selvitetään samanaikaisesti tuhansien geenien ilmentymistä
DNA-sirujen
eli geenisirujen avulla voidaan etsiä useiden, jopa tuhansien geenien
ilmentymistä samanaikaisesti, kun taas koettimen avulla voidaan etsiä vain
yhden geenin tai DNA-jakson ilmentymistä. Sirut ovat pieniä, ohuita muovi- tai
lasilevyjä, joiden pinnalla on säännöllisissä riveissä oleviin täpliin
kiinnittyneenä yksisäikeisiä DNA-koettimia. Tutkittava näyte pariutuu niiden
koettimien kanssa, joissa on vastaava emäsjärjestys. Koettimet ovat siis paloja
jostain geenistä tai sitä vastaavasta vastin-DNA:sta. Sirujen avulla voidaan
etsiä mm. geenimutaatioita.
DNA:n emäsjärjestyksen selvittäminen eli sekvensointi
Sekvensointi
tapahtuu siten, että ensin tuotetaan suuri joukko kaikenmittaisia DNA-pätkiä
PCR:n avulla. Kaikki nuo pätkät alkavat samalla alukkeella mutta päättyvät merkkiaineella
varustettuun nukleotidiin, joka lopettaa DNA-ketjun synteesin. Näitä synteesin
lopettavia nukleotideja on neljää erilaista. Niistä jokaisessa on emäs, jo
jokainen on merkitty erilaisella merkkiaineella. Ne lopettavat DNA-synteesin,
koska niiden sokeriosasta puuttuu hydroksyyliryhmä eli OH-ryhmä, mikä estää
seuraavan nukleotidin tarttumisen ja ketjun synteesin jatkumisen.
Tämän
jälkeen monistetut, erimittaiset DNA-palat järjestetään pituusjärjestykseen
elektroforeesin avulla. Sen perusteella voidaan päätellä emäsjärjestys. Elektroforeesissa
DNA-pätkien annetaan kulkea lasiputkessa olevan geelin läpi, jolloin
erimittaiset pätkät kulkevat eri etäisyyksille – lyhyet pitemmälle kuin pitkät.
Tunnistinlaite havaitsee eri merkkiaineilla merkityt lopettavat nukleotidit. Sitten
tulostin piirtää kuvion, josta näkyy vastinjuosteen emäsjärjestys tutkittavasta
DNA-jakosta. Merkkiaineen perusteella kukin lopettava nukleotidi tulostuu eri
värinä.
Ei kommentteja:
Lähetä kommentti