perjantai 3. lokakuuta 2014

Biologia 5: luku 8 Geenitekniikka



Biologia 5: luku 8 Geenitekniikka



Geenien tutkiminen aloitetaan DNA:n eristämisellä


Geenitekniikalla tarkoitetaan biologian menetelmiä, joilla eliöiden perintöainesta eristetään, analysoidaan, muokataan ja siirretään muihin eliöihin. Jotta geenejä voitaisiin tutkia, muokata ja siirtää, on DNA ensin eristettävä soluista, puhdistettava ja paloiteltava. DNA:n eristämiseen kuuluu kaksi vaihetta: DNA:n vapauttaminen soluista solurakenteita rikkomalla sekä DNA:n saostaminen syntyneestä liuoksesta. Bakteerien ja arkkien DNA saadaan irti soluista rikkomalla solut emäksisillä kemikaaleilla ja kuumennuksella.


Entsyymit ovat geenitekniikan työkaluja


Koska kaikkien eliöiden ja virusten DNA on perusrakenteeltaan samanlaista, voidaan geenejä siirtää eliöstä toiseen. Voidaan siis yhdistää kasvin ja eläimen tai bakteerin ja ihmisen DNA:ta ja saada siirretyt osat toimimaan uudessa isännässä. Ilman entsyymejä perimäaineksen tutkimus ja muokkaus olisivat mahdottomia. DNA:n käsittelyssä tarvitaankin monenlaisia entsyymejä, joista tärkeimpiä ovat katkaisu- ja liittäjäentsyymit, proteiineja pilkkovat proteaasit sekä DNA- ja RNA-ketjua rakentavat polymeraasientsyymit.

DNA:n kaksoiskierremolekyylin pätkimiseen käytetään bakteereista eristettyjä katkaisu- eli restriktioentsyymejä. Kukin entsyymi katkaisee DNA-rihman aina tietyn nukleotidijärjestyksen kohdalta. Siksi tarvitaankin satoja erilaisia katkaisuentsyymejä.

Kun DNA:ta pilkotaan paloiksi käyttämällä jokaisessa kohdassa samaa katkaisuentsyymiä, kaikki katkaisukohdat ovat samanlaisia. Ne sopivat täsmälleen toisiinsa ja muodostavat tarttuessaan uudelleen yhteen kaksijuosteista DNA-rihmaa emäspariperiaatteen mukaisesti. Sen lisäksi liitos sinetöidään liittäjäentsyymin avulla, joka muodostaa uudelleen DNA-juosteita koossa pitävät sidokset. Näin on mahdollista liittää kahdesta eri solusta tai eliöstä peräisin olevaa DNA:ta toisiinsa.

Tumallisen ja esitumallisen eliön DNA:ta ei voi suoraan liittää toisiinsa, koska tumallisten eliöiden geeneissä on proteiinia koodaavien osien, eksonien, lisäksi koodaamattomia osia eli introneja, joita esitumallisten geeneissä ei ole. Retro-RNA-viruksista eristetyn käänteiskopioijaentsyymin avulla se kuitenkin onnistuu. Entsyymillä voidaan tuottaa tumallisen eliön valmiin lähetti-RNA:n emäsjärjestyksen mukaan koeputkessa ensin yksi DNA-juoste ja siitä edelleen kaksijuosteinen DNA-molekyyli. Tätä sanotaan vastin-DNA:ksi. Se ei sisällä introneja eikä säätelyaluetta.


Geenejä voidaan tallentaa ja kloonata geenikirjastossa


DNA:ta voidaan varastoida bakteereihin, hiivoihin ja viruksiin. Bakteeriviljelmään siirrettyä jonkin eliön perimää tai sen osaa sanotaan geenikirjastoksi. Bakteerit lisääntyvät jakautumalla nopeasti, ja samalla kloonautuu myös niihin siirretty vieras DNA. Geenien siirto bakteereihin ja niiden monistuminen jakautuvissa bakteereissa on geenien kloonaamista. Bakteerien plasmidit ovat erinomaisia geenin vektoreita eli kuljettimia, koska niitä on helppo eristää bakteereista ja siirtää niihin takaisin. Myös bakteriofageja voidaan muunneltuina käyttää vektoreina geenien siirrossa. Niiden luonnollinen ominaisuus on siirtää perimänsä bakteeriin sen soluseinän ja –kalvon läpi ja valjastaa bakteeri tuottamaan virus-DNA:ta. Laboratoriossa siirretään ensin katkaisu- ja liittäjäentsyymien avulla  haluttu pala DNA:ta bakteeriviruksen DNA:han. Sitten viruksen annetaan siirtää se edelleen bakteeriin. Näin bakteeri alkaa tuottaa uusia viruksia, joissa kaikissa on mukana siirretty DNA-pala.



Onnistunut siirto tunnistetaan antibioottivalinnalla


Kun bakteereja kasvatetaan alustalla, on tärkeää tunnistaa ja poimia viljelmän joukosta ne, joissa on siirtogeenejä sisältäviä bakteereja. Esim antibioottiresistenssin aikaansaava geeni, joka usein on plasmidissa valmiina, on siirtogeenejä sisältävien bakteeriviljelmien löytämistä helpottava osa. Kun bakteereja kasvatetaan alustalla, johon on lisätty antibioottia, säilyvät elossa vain ne bakteerit, jotka kestävät kyseistä antibioottia ja joihin geenin siirto on siis onnistunut. Antibiootin avulla tapahtuvaa tietyn bakteerikannan seulomista suuresta bakteerimäärästä sanotaan antibioottivalinnaksi.


Geenikirjastoja on kahdenlaisia


Geenikirjasto eli bakteeriviljelmä on järjestämätön kokoelma kloonattuja DNA-jaksoja. Jos kyseessä on genominen geenikirjasto, siinä on mukana lajin koko DNA eli myös geenien ulkopuolinen ja intronien sisältämä DNA sekä geenien säätelyalueet. Jos halutaan kokoelma vain RNA:ksi luetuista geeneistä, on ensin eristettävä tutkittavista soluista lähetti-RNA:ta ja muokattava siitä koeputkessa käänteiskopioijaentsyymin avulla vastin-DNA. Kun se liitetään bakteeriviljelmän plasmideihin, saadaan vastin-DNA-kirjasto, jossa ei ole geenien introneja eikä säätelyalueita.


DNA:n tallentaminen geenikirjastoksi

                                                                                        
  1. DNA:ta (esim ihmisen) eristetään ja pilkotaan jollakin katkaisuentsyymillä sopivan mittaisiksi pätkiksi.
  2. Samalla entsyymillä katkaistaan myös bakteerien plasmidien DNA:ta, jos ihmisen DNA halutaan tallettaa bakteeriviljelmään.
  3. Pilkottujen DNA-pätkien annetaan sitten liittyä plasmideihin tai faageihin, joiden avulla ne siirtyvät bakteerien sisään.


DNA:ta monistetaan entsyymien avulla polymeraasiketjureaktiossa


PCR-menetelmä eli polymeraasiketjureaktio on bakteereissa tehtävää DNA:n monistamista nopeampi ja tehokkaampi tapa. PCR:n toiminta perustuu kuumien lähteiden bakteereista eristetyn DNA-polymeraasientsyymin käyttöön koeputkessa sekä monistettavien DNA-palojen toimimiseen malleina. Menetelmässä tarvitaan myös neljänlaisia nukleotideja sekä alukkeita, jotka ovat välttämättömiä DNA-polymeraasin toiminnalle.
                                                                                                                                                  
PCR:n avulla DNA:ta voidaan monistaa erittäin nopeasti ilman aikaa vievää kloonausta bakteeriviljelmässä. Oikeuslääketieteessä ja isyystutkimuksissa menetelmää käytetään yksilöntunnistuksen apuna.


Polymeraasiketjureaktio


PCR-menetelmällä saadaan DNA:ta monistettua. Menetelmä perustuu eri vaiheiden vuorotteluun, jolloin lämpötilaa muuttamalla saadaan DNA-ketju vuoroin avautumaan ja vuoroin rakentumaan uudelleen. Jokaisessa vaiheessa mallina olevan DNA:n määrä kaksinkertaistuu. Vaiheet toistetaan kymmeniä kertoja. Ensimmäisessä vaiheessa lämpötilaa kohotetaan niin, että DNA-juosteet eroavat. Toisessa vaiheessa lämpötilaa lasketaan, jolloin alukkeet pariutuvat juosteiden kanssa.

Kolmannessa vaiheessa nostetaan taas lämpötilaa, jolloin lämpöä sietävä DNA-polymeraasi rakentaa uudet juosteet. Kyseistä DNA-polymeraasientsyymiä on eristetty kuumien lähteiden bakteereista. Neljännessä vaiheessa samat vaiheet toistetaan, minkä tuloksena on neljä molekyyliä. Viidennessä vaiheessa toistetaan taas samat vaiheet, ja toisto toistolta DNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti.


DNA-palojen erottelu tehdään elektroforeesin avulla      


Elektroforeesin avulla voidaan erotella erikokoisia DNA-, RNA- ja proteiinimolekyylejä. Erottelussa käytetään apuna hyytelömäistä geeliä, jonka reunaan pipetoidaan paloitellut näytteet tiettyihin koloihin. Sitten systeemiin kytketään sähköjännite. Menetelmä perustuu siihen, että DNA-molekyylit ovat fosfaattiryhmiensä vuoksi negatiivisesti varautuneita ja liikkuvat sen takia sähkökentässä positiivista varausta kohti.

DNA-palat liikkuvat kohti positiivista varausta sitä nopeammin, mitä pienempiä ne ovat. Pitkät palat ehtivät liikkua vain lyhyen matkan, koska tiheä väliaine hidastaa niiden liikettä enemmän. Elektroforeesiajon loputtua haluttu raita voidaan leikata irti geelistä ja puhdistaa siitä DNA. Eri DNA-näytteistä saatuja raitoja voidaan vertailla keskenään ja käyttää saatuja tuloksia esim yksilöntunnistuksessa.



Elektroforeesi. Kuva Googlen kuvahaku.




Yksittäinen geeni etsitään koettimen tai PCR:n avulla


Koetin tarkoittaa geenitunnistinta. Se on geenin etsinnässä käytettävä työkalu ja en avulla geeni voidaan tunnistaa esim bakteeriviljelmässä olevasta geenikirjastosta. Geeni voidaan tunnistaa ja eristää myös PCR: ja elektroforeesin avulla. Koetin on lyhyehkö, yksijuosteinen DNA:n tai RNA:n jakso, joka varta vasten kootaan laboratoriossa. Sen käyttö perustuu nukleiinihappojen hybridisaatioon eli juosteiden pariutumiseen emäsperiaatteen mukaisesti. Siksi koetin pariutuu yksijuosteiseksi tehdyn DNA:n kanssa, jos juosteiden emäsjärjestykset vastaavat toisiaan.

Koettimeen liitetään merkkiaine, joka erottuu UV-valossa tai värireaktiossa. Sen avulla koetin ja myös etsitty geeni löytyvät elektroforeesin geelissä olevista raidoista tai geenikirjastosta kasvatetuista bakteeri-, faagi- tai hiivaviljelmistä.

Koettimen avulla voidaan tehdä geenitesti eli selvittää, onko jollain henkilöllä esim perinnöllistä sairautta aiheuttava alleeli, ns. ”sairausgeeni”. Bakteereissa oleviin geenikirjastoihin perustuva menetelmä on hankala ja melko hidas, mutta se sopii pitkien DNA-jaksojen etsimiseen. PCR-menetelmä onkin useimmiten nopein ja yksinkertaisin keino löytää ja eristää geeni.


Geenin poiminta geenikirjastosta koettimen avulla


Koetin liittyy tutkittavassa DNA:ssa kohtaan, joka vastaa sen emäsjärjestystä. Ensin bakteeeriviljelmän päälle painetaan huokoinen kalvo, johon bakteereja siirtyy. Kalvoa käsitellään siten, että bakteerit hajoavat ja niiden DNA:n kaksoiskierre aukeaa. Sitten kalvoa käsitellään liuoksella, jossa on merkkiaineella leimattu koetinta.

Koetin tarttuu niihin täpliin, joissa etsitty geeni on. Sen jälkeen kalvo värjätään, jolloin leimatun koettimen ansiosta syntyvät väripisteet osoittavat etsityn geenin sijainnin kalvolla. Kalvo on peilikuva maljasta. Sen perusteella löydetään myös maljalla olevan etsityn bakteeripesäkkeen sijainti. Pesäke sisältää tietyn geenin ja otetaan jatkokasvatukseen.


DNA-sirujen avulla selvitetään samanaikaisesti tuhansien geenien ilmentymistä


DNA-sirujen eli geenisirujen avulla voidaan etsiä useiden, jopa tuhansien geenien ilmentymistä samanaikaisesti, kun taas koettimen avulla voidaan etsiä vain yhden geenin tai DNA-jakson ilmentymistä. Sirut ovat pieniä, ohuita muovi- tai lasilevyjä, joiden pinnalla on säännöllisissä riveissä oleviin täpliin kiinnittyneenä yksisäikeisiä DNA-koettimia. Tutkittava näyte pariutuu niiden koettimien kanssa, joissa on vastaava emäsjärjestys. Koettimet ovat siis paloja jostain geenistä tai sitä vastaavasta vastin-DNA:sta. Sirujen avulla voidaan etsiä mm. geenimutaatioita.


DNA:n emäsjärjestyksen selvittäminen eli sekvensointi


Sekvensointi tapahtuu siten, että ensin tuotetaan suuri joukko kaikenmittaisia DNA-pätkiä PCR:n avulla. Kaikki nuo pätkät alkavat samalla alukkeella mutta päättyvät merkkiaineella varustettuun nukleotidiin, joka lopettaa DNA-ketjun synteesin. Näitä synteesin lopettavia nukleotideja on neljää erilaista. Niistä jokaisessa on emäs, jo jokainen on merkitty erilaisella merkkiaineella. Ne lopettavat DNA-synteesin, koska niiden sokeriosasta puuttuu hydroksyyliryhmä eli OH-ryhmä, mikä estää seuraavan nukleotidin tarttumisen ja ketjun synteesin jatkumisen.

Tämän jälkeen monistetut, erimittaiset DNA-palat järjestetään pituusjärjestykseen elektroforeesin avulla. Sen perusteella voidaan päätellä emäsjärjestys. Elektroforeesissa DNA-pätkien annetaan kulkea lasiputkessa olevan geelin läpi, jolloin erimittaiset pätkät kulkevat eri etäisyyksille – lyhyet pitemmälle kuin pitkät. Tunnistinlaite havaitsee eri merkkiaineilla merkityt lopettavat nukleotidit. Sitten tulostin piirtää kuvion, josta näkyy vastinjuosteen emäsjärjestys tutkittavasta DNA-jakosta. Merkkiaineen perusteella kukin lopettava nukleotidi tulostuu eri värinä.


Ei kommentteja:

Lähetä kommentti